MKS生命与健康科学应用之多光子成像

在过去的二十年里，生物成像已经从飞秒超快激光器技术的广泛使用中受益。飞秒和皮秒脉冲都可以在生物样品内部引起独特的物理过程，这些有价值的物理过程是传统的共聚焦成像无法得到的。选择多光子成像而舍弃传统的共聚焦成像，其中的主要动机是能够在脑组织等不透明样品更深入的位置成像。如何实现这一点？成功的多光子成像实验又需要哪些实验条件呢？

产生多光子图像的方法是同时吸收来自各种荧光染料的两个或更多光子。在过去的二十年里，多种荧光染料的出现将可行的多光子成像光谱范围延伸到了 (680 – 1300 nm)。图 1 中显示了各种染料的成像情况染料用作荧光标记，用于调查特定的生物过程和结构。因为多光子吸收过程与光子密度最高的区域相关，所以产生的荧光集中在焦平面上。无需机械孔径即可丢弃平面外的荧光信号，从而减少散射和光损伤。此外，因为多光子成像采用近红外激发波长，所以可以生成深入样品 1 mm 以上的三维图像。

▍多光子成像的演变

自二十世纪九十年代初以来，钛宝石 (Ti:sapphire) 激光器一直是多光子成像的首选光源。全固态结构可在近红外光谱区 (700 – 1000 nm) 内实现稳定可靠的操作。在应用于多光子成像之后，2 光子和 3 光子过程的可行吸收区分别转变为 (~350 – 500 nm) 和 (~233 – 333 nm)，这是各种生物相关荧光团的理想范围。

最流行的荧光蛋白在波长高于 900 nm 的双光子范围中实现最佳激发：eGFB (930 nm)，eYFP (960 nm)；而 mCherry、tdTomato、DSRed 和 E2-Crimson 等红色荧光蛋白在 1000-1100 nm 范围实现最佳激发。

最新一代用于多光子成像的激光器以镱 (Yb) 为基础。这些光源利用非线性频率变换来实现 680 – 1300 nm可行范围。除了可调谐输出，这些新的激光器还提供高功率固定波长输出，实现了各种新的无标记技术 例如二次谐波产生  (SHG), 三次谐波产生 (THG), 相干反斯托克斯拉曼散射 (CARS) 和 受激拉曼散射 (SRS). 这些无标记形式能够揭示生物样品中天然存在的内生结构，如果一起使用，可以在与传统的多光子成像关联时产生更详细的照片，如下图 1 中所示。

图 1. 多光子成像性能曲线

▍多模态成像

通过采用双输出光束来实现同时激发，新的平台已经准备好满足多模态成像不断变化的需求。巴黎居里研究所/CNRS 的 Marie Irondelle 博士研究乳腺肿瘤的发展（见图 2。这项体外实验在对小鼠乳腺进行成像时未使用任何荧光染料。Irondelle 同时观察到 SHG 成像中的胶原蛋白（品红色）和 THG 成像中的脂肪细胞（黄色）。

多模态成像形式非常有助于进行体内实验。悉尼癌症医学与细胞生物学百年研究所的 Michael Kuligowski 博士调查皮肤中的 T 细胞与树突状细胞的相互作用（见图 3）。在这项实验中，标有 CMTPX 的 T 细胞提取自一只供体小鼠，并注射到树突状细胞标有 GFP 的另一只小鼠体内。标有 GFP 的树突状细胞使用调谐至 925 nm 的 Mai Tai(®)DeepSee™ 钛宝石激光器进行成像，而标有 CMTPX 的 T 细胞使用调谐至 1080 nm 的 InSight(®) DS+ 激光器进行成像。这项实验观察单个 T 细胞与树突状细胞进行大约 40 分钟的相互作用。

图 2. 使用 InSight DS+™ 进行成像的小鼠乳腺胶原蛋白（SHG，品红色）和脂肪细胞（THG，黄色）的无标记图像。

另一项实验使用多光子成像来跟踪斑马鱼全胚胎的早期发育。法国伊维特河畔吉夫法国国家科学研究中心的 Nadine Peyrieas 博士使用 InSight DS+ Dual 光器对胚胎进行了八个小时的跟踪，如下图 4 中所示。 这项实验使用该激光器的双光束配置，实现了 980 nm 和 1041 nm 的同时多光子成像。 胚胎细胞膜标有 eGFP，细胞核标有 mCherry。

图 3. 在 T 细胞和树突状细胞与小鼠皮肤相互作用的数小时内，双色同时成像可以对它们进行连续跟踪。图片由癌症医学与细胞生物学百年研究所的 Michael Kuligowski 博士提供。

使用降低功率的 MPEF 显微镜，可以对斑马鱼全胚胎的早期发育进行连续成像。在本例中，法国伊维特河畔吉夫法国国家科学研究中心的 Nadine Peyrieas 博士使用配备了 InSight DS+ Dual 激光器的显微镜对发育过程进行了八个小时的跟踪（见图 4）。胚胎细胞膜标有 eGFP，细胞核标有 mCherry。这项实验使用该激光器的双光束配置，分别以 980 nm 和 1041 nm 同时对 eGFP 和 mCherry 进行成像。胚胎按顺序从前面和后面成像。

图 4. 多光子成像适用于活体斑马鱼发育的长期监控。对标有 eGFP 的细胞膜和标有 mCherry 的细胞核进行的同时跟踪，揭示了发育过程的生动细节。(a) 0、(b) 4、(c) 6 和 (d) 8 小时的胚胎发育阶段。图片由 CNRS 的 Nadine Peyrieas 博士 和 LaVision Biotec 提供。