MKS生命与健康科学应用之先进的生物成像技术

几个世纪以来，光学显微镜一直是生命科学研究的工具。自从激光发明以来，许多使用显微镜的先进生物成像技术已经被创造出来，在过去的二十年里快速发展。由于光的散射，光学穿透深度的限制，最初限制了对薄样品的研究，并且出于必要，限制了生物体外部（体外）发生的过程。近年来，活体技术已经发展起来，可以在活生物体或细胞内进行可视化，并大大增加了对细胞功能的理解。任何生物成像技术都需要通过某种对比方法从细胞或生物体的每个部分生成信号。其中一些技术需要将外源性造影剂（起源于生物体或细胞外部）添加到正在研究的样品中，例如荧光染料。这些试剂可以被专门设计并针对特定分子。在其他情况下，信号可以用内源性造影剂（那些自然起源于生物体或细胞内部的造影剂）产生。这种途径具有不扰乱原始组织微环境的优点，并限制可能的细胞毒性。

传统的显微镜技术在横向（样品平面内）提供了出色的空间分辨率，通常在1μm以下。然而，进入样品深度的轴向分辨率通常要差得多。已经开发了多种先进的生物成像技术来提高轴向分辨率，并允许重建样品的真实3D表示。这些技术中的主要技术是共聚焦显微镜，其中通过添加共焦孔来提高轴向分辨率，共焦孔可以区分样品中不同深度发出的光。双光子荧光显微镜中描述了共聚焦显微镜。

在过去的二十年里，利用皮秒和飞秒激光源提供的高峰值功率，开发了广泛的基于激光的非线性显微镜。在任何情况下，激发都是与强度相关，因此在激光束焦点处激发效率最高。这可以在不使用共焦孔径的情况下将轴向分辨率提高到约1μm。超分辨率显微镜、双光子荧光显微镜和三光子荧光显微镜 描述了非线性显微镜技术，并在表1中概述了使这些技术的各种机制。激光光谱调谐 描述了与这些技术相关的各种类型的波长转换和产生过程。所有这些技术都需要高峰值功率的超快激光器，有些需要两个不同波长的同步超快激光器。一些技术适用于内源造影剂，而另一些技术则需要添加荧光染料。图1显示了每种机制的能级图，它揭示了激光如何与系统相互作用以产生可测量信号。这些图表将在后续章节中被引用。

表 1。用于非线性显微镜技术的机制比较。

▍双光子荧光显微术                          

在共聚焦激光扫描显微镜中，从聚焦激光产生的荧光被成像到针孔或共焦孔径上，针孔或共焦孔径阻挡在焦平面上方或下方产生的荧光。然后，当光束水平扫描样品时，测量荧光的强度，以建立2D图像。最后，样品在Z方向上顺序移动，允许以接近衍射极限的空间分辨率构建3D图像。这种共焦激光扫描显微镜技术可以追溯到1969年。双光子荧光（2PF）显微镜的示意图如图2所示。请参阅双光子荧光显微镜（2PF） 了解更多信息。

▍三光子荧光显微术

三光子荧光（3PF）显微术可以在强散射样品（如小鼠大脑）中提供比2PF显微术明显的优势。来自三光子激发的荧光下降为1/z（4），其中z是离焦平面的距离，而来自双光子激发的荧光下降为1/z（2）。因此，三光子激发减少了远离焦平面区域的背景，并将信号与背景比提高了几个数量级。背景的这种减少在图3中进行了说明，其中2PF和3PF进行了比较。有关更多信息，请参见三光子荧光显微术（3PF） 。

图3.来自2PF（左，在920 nm）和3PF（右，在1300 nm）显微镜的荧光素标记的血管在小鼠小脑中650µm深的图像的比较，这两个图像具有相当的信号强度，并以相同的对比度设置显示，比例尺条，50µm…

▍CARS 和 SRS 拉曼显微镜

拉曼显微术是一种能够实现无标记化学成像的技术。它基于由C. V.拉曼在20世纪30年代早期发现的分子的拉曼散射效应。当具有特定波长或光子能量的光入射到分子上时，它可以被非弹性散射。这意味着部分能量被分子吸收，散射的光子的能量低于入射光子（见图4）。吸收的能量的比例取决于分子的振动频率。所有分子都有特定的拉曼频率，通常以波数给出，范围从100 cm-1到3500 cm-1。分子的拉曼光谱高度依赖于其化学结构，但大多不受局部环境的影响。因此，拉曼光谱不仅具有特异性，而且对环境变异性具有鲁棒性。有关更多信息，请参见拉曼光谱（CARS和SRS） 。

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